29.1

29. replikace DNA

Replikace DNA

            DNA i RNA jsou v buňkách syntetizovány polymerací deoxyribo -, resp. ribonukleotidů. Matricí, jež určuje pořadí nukleotidů v nově syntetizovaných řetězcích DNA i RNA a tím i přesné znění genetické informace v nich zapsané je obecně řetězec DNA (u RNA-virů RNA). Prvním předpokladem pro syntézu kterékoliv nukleové kyseliny je odvinutí řetězců z dvouřetězcové molekuly DNA, druhým je zásoba volných nukleotidů, třetím je přísun energie ve formě makroergních fosfátových vazeb a čtvrtým enzymatický aparát, který celou syntézu řídí. Enzymy, jež fosfodiesterickými vazbami navzájem náží nukleotidy, tj. polymerují vlákno nukleové kyseliny, jsou DNA či RNA polymerázy. Syntézou DNA (podle DNA) vznikají vždy dvě totožné dceřiné molekuly DNA, tedy dvě její repliky (syntéza = replikace).

            Syntéza DNA

                       S fáze – probíhá replikace jaderné DNA.

            Mimo S fázi probíhá replikace nejaderné DNA a DNA, která je spojena s reparačními procesy, které odstraňují většinu genových mutací (neprogramovaná syntéza).

            Semikonzervativní – z každé makromolekuly vznikají makromolekuly dvě, identické navzájem i s makromolekulou původní (mateřskou), takže obě nesou zcela stejnou genetickou informaci. Při replikaci DNA slouží jako matrice oba polynukleotidové řetězce molekuly mateřské. Každou z obou výsledných replik pak tvoří vždy jeden řetězec z molekuly mateřské a k němu komplementární řetězec nově syntezovaný. Tento způsob replikace se označuje jako semikonzervativní a je obecný pro DNA všech buněk prokaryontních i eukaryontních a virů s dvouvláknovou DNA.

            Vysoká přesnost – správnost replikace DNA je „střežena“ buněčnými korekčními systémy a naprostá většina chyb, k nimž při replikaci dochází, je okamžitě reparována.

Morfologická a současně funkční jednotka, na jejíž úrovni buňka reguluje jednotlivé kroky, se obecně nazývá replikon. Replikony životní důležitosti pro buňku, jaderné chromosomy, jsou v průběhu každého buněčného cyklu replikovány vždy jen jednou. Replikony nejaderné (chromosomy organel) a přídatné (plazmidy, DNA virů) jsou obvykle během buněčného cyklu replikovány opakovaně. Replikon nese dvě kontrolní sekvence pro replikaci – počátek, kde jeho replikace začíná, popřípadě i terminační sekvenci, kde se jeho replikace zastavuje. Replikonem je kterákoliv molekula DNA, která nese počátek a může být tedy v buňce autonomně replikována. Prokaryontní chromosom představuje jediný replikon, jehož replikace je regulována iniciací v jediném počátku, eukaryontní chromosom je tvořen více replikony. Všechny replikony se musí jednou zreplikovat během buněčného cyklu, děje se tak postupně a tak musí existovat mechanismus rozlišující již zreplikované replikony.

Origin recognition complex (ORC) – komplex, který se váže na určitou sekvenci v genomu, kde začíná replikace. Usměrňuje DNA replikaci a je důležitý pro iniciaci.

Replikační foci – místa v jádře, kde dochází k replikaci DNA a kde se nově syntetizovaná DNA akumuluje.

Cytologická jednotky – měnící se topografie.

Strukturní determinanty – lamina, organizátory chromatinu (globální, specifické), nukleozomy (vázající proteiny).

Replikátory – DNA sekvence.

Iniciace – iniciace replikace se projeví lokálním rozvolněním (vzájemným odvinutím) obou vláken DNA replikonu v sekvenci jeho počátku. Zde na duplex DNA „nasedá“ rozvinující protein (DNA helikáza), který pak po něm určitým směrem „projíždí“. Přitom přerušuje vodíkové můstky mezi dalšími páry nukleotidů a tak odvíjí oba řetězce. Místo, kde se obě vlákna od sebe odvíjejí se označuje jako replikační vidlice. Dvoušroubovice se na konci vidlice utahuje a vzniká tam tlak. To řeší topoizomerázy, které jsou schopné přestřihnout jedno z vláken, uvolnit tlak, a znovu ho slepit

Klinický význam – Inhibitory topoizomeráz – cytostatická léčiva. Mutace „Loss of function“ v rekombinačních helikázách – nestabilita DNA, senescence, dědičné Bloomův, Wernerův a Rothmund-Thomsonův syndrom.

            Elongace – vstupní sekvencí (primerem) pro syntézu každého polydeoxyribonukleotidu je krátký úsek RNA, který nasedá na 3´-OH skupinu deoxyribonukleotidu. Teprve na jeho volný 3´-OH konec připojuje DNA polymeráza (prokaryo 3 – I, II, III; eukaryo 5 – α, β, γ, δ, ε) první deoxyribonukleotid. Po splnění své funkce jsou primery RNA od vlastních polydeoxyribonukleotidů enzymaticky odstřiženy a chybějící sekvence je doplněna. Poněvadž polymerace nukleotidů probíhá ve směru 5´-> 3´, jsou obě vlákna syntezována antiparalelně, protože DNA polymeráza umí připojit nukleotidy pouze na 3´C deoxyribózy. Tento problém buňka řeší tak, že na matrici vlákna, jež je exponováno ve směru 5´-> 3´ syntezuje sice vlákno globálně antiparalelně, tj. 3´-> 5´, ale po řadě krátkých fragmentů, z nichž každý je syntezován s obvyklou polaritou 5´-> 3´. Syntéza tohoto vlákna je diskontinuální. Na vlákně odvíjeném ve směru 3´-> 5´ může ovšem současná syntéza nového vlákna probíhat kontinuálně (5´-> 3´). Krátké úseky vlákna o cca 1000 – 2000 (100 – 200) nukleotidech, syntezovaný na matrici vlákna odvíjeného ve směru 5´->3´, se nazývá Okazakiho fragment.

Okazakiho fragment – tyto fragmenty zákonitě vznikají při každé replikaci DNA, prokaryontní i eukaryontní. Teprve v dalším průběhu replikace jsou postupně kovalentně spojovány v úseky stále delší až nakonec v úplné vlákno DNA. Na začátku každého Okazakiho fragmentu se musí pokaždé vytvořit nový RNA primer, ten je později vystřihnut a Okazakiho fragmenty jsou pospojovány DNA ligázou (fosfodiesterické vazby).

Protože je jedno vlákno DNA syntezováno diskontinuálně a druhé kontinuálně, je dvouvláknová DNA vcelku syntezována semidiskontinuálně.

SSB protein – bílkoviny, které se vážou na vlákno DNA v rreplikační vidlici a zamezují DNA, aby se sbalila do svého dvoušroubovicového tvaru.

            Terminace – protože eukaryotické chromozomy jsou lineární, DNA polymerázy nejsou schopné replikovat jejich koncové části, tzv. telomery, a tak je replikovaná DNA nepatrně kratší, než původní.

Telomery – koncové části chromozomů. Při buněčném dělení se zkracují, ale jejich délka se obnovuje během tvorby pohlavních buněk činností enzymu telomerázy. Zkracování telomer vede ke stárnutí buňky. Mechanická ochrana konců chromozomů, brání před rekombinací s jinými chromozomy, zamezuje zkracování oblastí nesoucích geny, ochrana proti rakovině. Heterochromatin, tandemové repeaty TTAGGG. Telomerické smyčky (DNA + proteiny).

Telomeráza – enzym pracující jako reverzní transkriptáza, který je schopen prodlužovat telomery. Za normálních okolností pracuje pouze v dělících se zárodečných buňkách. V klasických buňkách je její funkce blokována (výj. nádorové). Když mají nádorové buňky zablokovanou telomerázu, po určitém počtu dělení umírají. Obsahuje RNA molekulu.

Ribozym – katalyticky aktivní molekula RNA, která funguje jako enzym. Nejčastěji katalyzují štěpení cukr-fosfátové kostry RNA buď vlastního vlákna (cis) nebo RNA vlákna jiné RNA (trans).

Hayflickův limit – číslo, které určuje kolikrát se lidská buněčná populace rozdělí, než se buněčné dělení zastaví. Telomery se při každém dělení zkracují, až dosáhnou kritické délky.